周信芳，原名士楚。原籍浙江慈溪（今宁波市慈城镇），1895年1月14日（清光绪二十年十二月十九日）生于江苏清江浦（今淮阴市）。父慰堂，艺名金琴仙，工京剧旦角。母许桂仙，亦为京剧演员，工青衣。当时社会上视戏曲行当为贱业，曾是官宦之家的周氏家族因此将周慰堂逐出族门，慰堂夫妇于是流浪江湖。周信芳自小随父母流徙各地。6岁在杭州开始学戏，初拜文武老生陈长兴为师，继拜老生王玉芳、邵寄舟为师，这为他日后的艺术发展打下了坚实的基础。第二年，他便以"小童串"名义登台演《黄金台》中的田法章。小孟七到杭州演《铁莲花》时，就邀他演娃娃生定生，并用"七龄童"艺名。周信芳从此专应各班中所需的娃娃生。当时，以演红生（关羽戏）及徽调衰派老生著称的三麻子（王鸿寿）和以演孙悟空著称的赛活猴（郑长泰）都曾对之有所指点。周信芳不断努力练功，同时从与前辈名家合作演出和观摩他们演戏中悉心体会其中一招一式的细腻之处，学习他们塑造人物的方法。
1906年他12岁时，随父送其师陈长兴到上海。后陈去天津，他则落户上海。三麻子带他去汉口演出，他先演娃娃生，后演老生戏、武生戏，并兼演梆子戏。回上海后，先后加入玉仙茶园、春仙班，并到南京、苏州、镇江、芜湖等地演出。曾用艺名"万年青"、"时运奎"、"七灵童",与孙菊仙、林颦卿、李春利同台，受到他们的点拨，并拜"李派"武生的创始人李春来为师学武生戏。其时他还向几位老师学艺，刘双全教他武老生戏，潘连奎教他以念白为主的戏，张和福教他做功戏。在到处搭班的过程中，他曾与花脸刘永春同班，刘永春善于根据人物处理唱念表演，对他影响很大。
他13岁改用"麒麟童"艺名。当时他在上海丹桂第一台搭班演出。秋，曾到烟台、大连、天津各地演戏，一方面为补助家用，另一方面，则为了增长见识，充实自己。
翌年，周信芳进北京。那是"喜连成"科班因为营业不好，邀班外演员搭班演出，听说周信芳能演老生戏、武生戏，还能演老旦和丑角，便专程从天津邀来北京。同时邀来的还有梅兰芳、林树森、贯大元等。周信芳与梅兰芳合演过《战蒲关》、《九更天》等。有周信芳、梅兰芳等人加盟，"喜连成"果然红火起来。周信芳在北京还搭过"得胜奎"科班演出。当时他已是以演做工老生戏为主。一年后，他再到天津与吕月樵、何月山、苏廷奎、金月梅等同班演出。然后再北上，到海参崴、双城子一带演出。这次离沪北行，周信芳不仅观赏到前辈名家谭鑫培、汪桂芬等人的演艺，长了见识，而且参加了金月梅等革新家演的新戏，思想起了很大的变化。
1912年，周信芳回到上海。在新新舞台，他先后与四盏灯（周咏棠）、李琴仙、苗胜春、李吉瑞、孙菊仙、赵君玉、冯子和、老票友江梦花及谭鑫培等同台演出，并专诚向谭鑫培学了《御碑亭》、《桑园寄子》、《打棍出箱》、《打侄上坟》等戏，学习了如何用眼神、手势、身段、道具等表现人物内心活动的方法。他此时又参加了冯子和排演的新戏的演出，受到新思想的熏陶。
当时，他受到辛亥革命思想的影响，特别是当时京剧界的先行者潘月樵、夏月珊、夏月润、刘艺舟以及王钟声等人的革命行动和演出进步的新戏给他以直接影响，他自己说："我也被这种热潮卷进去了。"于是在1912年与一盏灯（张云青）、林颦卿、赵君玉等演出了《民国花》、《新三国》，宣传革命、谴责袁世凯；1913年又与赵君玉等合演《宋教仁遇害》（当时被迫停演，后又与三麻子、吴彩霞等重演），揭露袁世凯暗杀宋教仁的卑劣行径。这种以戏曲为武器，与反革命进行斗争的做法，从这时开始，贯穿了周信芳的一生。
1915年，周信芳21岁时，加入丹桂第一台，一直演到1923年，并兼任后台经理。这8年，是周信芳的艺术生涯中非常重要的8年，他当时已是个成熟的青年，经过了十几年的学戏、演戏，见识很多，实践很多，从感性认识逐渐上升到理性认识，在戏剧演出上进入了新的阶段，有意识地对戏剧艺术进行革新、创造，为形成自己独特的艺术风格奠定了坚实的基础。
那一时期，周信芳的合作者先后有三麻子、冯子和、汪笑侬、欧阳予倩等，他们都是京剧的革新家，是他们参加创建了南派（海派）京剧。周信芳与他们合作演出，一起编剧，一起演戏，受他们的影响和熏陶，自己也成为一个南派京剧的革新家。
三麻子，周信芳说他"京徽诸剧，文武皆能。红生尤为著名".说他演戏经常在改，"不改革变化，是不能贡献出他的长处".说与他同隶丹桂第一台时，"朝夕亲炙，觉其艺术，实有过人之处".冯子和，周信芳说"他是唱旦的革新家，他演戏不拘形式；戏剧上故意的做作，被他大胆地革除了不少，完全趋于真实、自然".周信芳演戏追求真实、自然、生活化，就是从冯子和那里学来的。汪笑侬，周信芳说"他的艺术渊博浩瀚，集各派之大成",说他的唱"饶有感情",他的"做工表情以细致逼真、结合剧情著称，实际就是着重刻划人物、演谁像谁的意思".而且他善于写戏，"通过戏剧来抒发他的爱国热情".欧阳予倩，既是中国话剧运动的奠基人，又曾演过文明新戏，编演京剧更是声名卓著。周信芳说，"他给我国的旧剧带来了新思想、新剧目以及新的表现手法".这样一些革新家，给周信芳的影响极大。这8年中，据统计，周信芳首演的剧目共255出，其中新编剧目122出，参加别人的新剧目87出。新戏中有不少是连台本戏，有的用了布景，也有的用了机关布景，舞台上出现很多新的事物。他所演的新戏，有不少是他自己编写的。当时他已经"知道世事潮流，合乎观众心理".其中也包括为了适应上海那一座被称作"十里洋场"的城市的群众欣赏要求的连台本戏。1915年，他曾与冯子和等演出《中外共和》（即《南北和》），呼吁统一，反对军阀分裂；又演了《王莽篡位》、《疯僧扫秦》；还与欧阳予倩合演了《昏皇鉴》，都是讽刺袁世凯称帝的新戏。1919年，配合五四运动，他与任天知、王灵珠等合演了《学拳打金刚》。他还与汪笑侬合演了汪笑侬编写的一些"愤世嫉俗"、配合时事的戏，如《党人碑》、《哭祖庙》、《两朝领袖》、《不忍心》等新戏。在那几年中，他向三麻子学了《徐策跑城》、《扫松下书》、《斩经堂》等从徽剧移植来的剧目和关公戏（红生戏），丰富了自己的艺术，后来这些剧目成了他的拿手戏。他还向黄（月山）派武生马德成学了戴白髯的武老生戏，使他在这一方面形成自己的特长。为了演出的需要，他又常扮演一些年轻的角色，文的，武的，上至帝王将相，下至贩夫走卒，因此，他不断总结经验，不断磨练改进，终于创建了一个新的行当——大嗓小生，它既不同于传统小生的大小嗓结合的唱念，又不同于老生的表演，这竟成了他的特有的创造。他除了演老生、小生之外，还演武生、花脸、小丑、老旦，其中既有古装戏，也有时装戏，大大锻炼了他的艺术才能。
为了革新舞台艺术，在表演、服饰、化妆、布景等各方面，丹桂第一台的演职员们都做着各自的实验，逐渐形成了以后台经理周信芳为中心的革新小组。他们互相探讨，各自摸索，反复研究，取得了经验。例如为了演好时装戏，他们试着在没有水袖的时候发展手的表演；不戴髯口改为粘胡子；关羽用五绺髯，不再用原来的三绺等等。他们这些革新的尝试，强调要根据表现剧中人物的需要，试成功了就采用，不成功再改回来，这就突破了一些已经形成固定模式的框框。周信芳在汪笑侬、三麻子等演出的《张松献地图》剧中扮演刘备，为了既不失其身份，又不至于把剧中主角、身为客卿的张松压下去，他创造了内穿铠甲、外罩官衣的扮像，铠甲因而变化了原形，改成较为轻便、紧凑、抱身的样式，后来逐渐发展、推广，终于成了一种被普遍采用的"改良靠".
为了提高自己的文学修养和艺术修养，周信芳很重视读书。当他在"喜连成"搭班演戏时，教师萧长华就见他在没事的时候，"总是以书为伴，手不释卷";后来他在丹桂第一台，又受到汪笑侬、冯子和、欧阳予倩等有文化的人的影响，更是经常带着书下后台，有一点时间都拿出书来读。同时，他还经常对同班的演员讲学文化的重要性，并要他们让孩子多读书，特别强调要演好戏必须要多读书。
1923年2月，周信芳离开了丹桂第一台，北上烟台、天津、大连、北京，与盖叫天、林颦卿合演，演出了他的独家剧目《萧何月下追韩信》等。他还在"二七"大罢工时，排演了《陈胜吴广》，以揭露统治者的残暴。然后又经济南、青岛，回到上海。1925年重进丹桂第一台，演出了连台本戏《汉刘邦统一灭秦楚》，他在这出戏里，扮演过刘邦、韩信、张良、项羽、范增等角色。剧中的《九战章邯》、《鸿门宴》、《韩信》、《博浪锥》、《圯桥进履》等后来都作为单折戏演出了。其后，周信芳一度又离开了丹桂第一台。1927年，周信芳三进丹桂第一台，在演出连台本戏《飞龙传》、《天雨花》之后，又转入老天蟾舞台，排演连台本戏《华丽缘》。发展到后来，《飞龙传》中的《北汉王》、《天雨花》中的《左维明巧断无头案》、《华丽缘》中的《小春亭》等都成为折子戏的保留剧目。
同年，周信芳加入了田汉主持的进步话剧团体南国社，在欧阳予倩自编自演的《潘金莲》中扮演武松。他与田汉的交往是在4年前开始的，那年他慕名去访田汉，两人一见如故，成了莫逆之交。1930年，反动当局查封了南国社，搜捕田汉，是周信芳设法掩护田汉逃出了魔爪。
周信芳的青年时代，三进丹桂第一台，正是他提高思想，广收博采，积累经验，阔步前进的时期。在他演出的戏中，有不少从内容到舞台艺术都成为当时革新戏曲的典型。在戏曲改革的摸索研究中，他也逐渐形成了自己的艺术特点，终至创建了独树一帜的艺术流派，世称"麒派".
周信芳在老天蟾舞台演了3年多，主要是演连台本戏，如《华丽缘》、《龙凤帕》、《封神榜》。他在《封神榜》一剧中，扮演了姜子牙、比干、梅伯、闻太师、黄滚、殷郊、伯邑考、土行孙等，不同角色，各有创造，而其中的《鹿台恨》、《炮烙柱》、《反五关》等折子戏，也都成了"麒派"的保留剧目。
从1929年起，周信芳担任了上海伶界联合会的宣传部长、会长，并主持编辑《梨园公报》。此前，周信芳曾在《梨园公报》上发表过评论谭鑫培和为伶人伸张正义等文章，田汉、欧阳予倩也都发表过讨论戏剧运动的文章，周信芳接手后，《梨园公报》更成为探讨京剧改革的园地。
1931年日寇侵华，在九一八事变后40天，周信芳就开始演出了新编的连台本戏《满清三百年》的头本，以洪承畴降清的故事，鞭挞"不抵抗主义者"和投敌的汉奸。接着又演出了二本，以崇祯殉国来写亡国之痛。三本写爱国才子冒辟疆与爱姬董小宛遭敌人、汉奸所害而生离死别的故事。然后他又把这三本戏改成各自独立的三出戏：《洪承畴》、《明末遗恨》、《董小宛》，并带着这几个剧目和过去与高庆奎合排的《卧薪尝胆》等剧，到青岛、济南、天津、北平、南京、苏州及伪满洲国各地演出。1935至1936年，重回上海，并到杭州、宁波等地演出。
1937年七七事变爆发时，周信芳正在天津演出，当即停演南下，回到上海，参加由田汉、欧阳予倩等主持的戏剧界讨论抗日救亡运动问题的座谈会，并共同组建了"上海戏剧界救亡协会".周信芳在这个时候结识了上海文艺界共产党组织的领导人之一于伶。其后，他为慰问八一三淞沪抗战的伤兵，为抗战募捐演出，组织成立"上海京剧界抗敌救亡演出队",还率剧团到胶州公园为坚守在四行仓库孤军奋战的八百壮士慰问演出。
上海沦陷，田汉、欧阳予倩等先后去大后方，周信芳仍坚持在上海演出。他重组移风社，社内有近200人，以卡尔登戏院为阵地，演出配合抗战的剧目，并藉以维持一部分京剧艺人的生活。从1937年10月，周信芳在这里坚持了4年。他先排演了《亡蜀恨》，这是反映蜀汉时期，主上昏庸，自毁良才，最后投降敌人，导致孤忠殉国的令人痛心的历史故事。排这个戏，意在激励国人要上下一心守土抗战。他又排演了《洞庭湖》，讲岳家军团结军民同御外侮的故事。他又排演了新戏《香妃恨》，这是讲清乾隆帝平回部，掳回香妃，欲纳为妃，香妃不允，因思念故国而伺机报仇，最后为太后赐死的故事。周信芳藉剧中香妃不甘屈服的抗争，来唤起中华民族对侵略者的反抗。他又排演了《徽钦二帝》，周信芳饰演宋徽宗，把一个亡国之君的痛苦淋漓尽致地表现出来；剧中还刻画了儿皇帝张邦昌的丑恶嘴脸和爱国恋君的妓女李师师的以死抗贼。当该剧上演时，敌特寄来子弹加以威胁，但周信芳毫不畏惧，仍坚持演了三个星期。后来，周信芳又排演了《文天祥》一剧，演出后，立刻又遭到反动统治者的禁演。他于是便把《文天祥》与《史可法》作为新戏预告，贴在演出的舞台两侧，让两位民族英雄的名字醒目地映现在观众眼前，以激励人们的抗日斗志。
他还参加为救济难民义演的话剧《雷雨》演出，饰演周朴园。当上海日伪特务机关要他去演堂会戏时，他断然拒绝。
在敌伪统治时期，中国共产党上海地下组织派姜椿芳与周信芳保持联系。1945年抗战胜利后，田汉等回到上海，马上与周信芳取得联系，对他在敌伪统治时期的爱国行动予以充分肯定。田汉有诗称赞梅兰芳、周信芳等："留须谢客称梅大（按：指梅兰芳抗战八年中蓄须明志的斗争行动），洗黛归农美玉霜（按：指程砚秋不与日伪合作到北平郊区青龙桥去种田）；更有江南伶杰在，歌台深处筑心防。"1946年9月16日，周恩来到中国共产党驻沪办事处，会见了上海文化界田汉、阳翰笙、夏衍等，周信芳和越剧演员袁雪芬也参加了会见。10月21日，周恩来宴请了周信芳和白杨、黄佐临等。敌伪统治时，在中共地下党领导下，上海京剧界的一些进步青年组成了"艺友座谈会",经常在一起研究京剧改革问题，周信芳对之十分支持。这个会一度被迫停止活动，抗战胜利后又恢复活动，周信芳参加并担任了主持人。这个组织后来改名为"伶界联合会艺友联谊会",但因与文化界其他七团体联合致电慰问在晋京请愿反对内战遭到国民党特务殴打的人民代表而被当局查禁。
抗战胜利后，周信芳参加了不少政治斗争，他参与了反内战、争自由宣言，反对演员登记，反对裁撤上海市立戏剧学校，要求豁免娱乐捐和所得税等的签名活动，因而受到了当局的传讯。
上海解放前夕，国民党反动派准备裹胁周信芳到台湾，中共地下组织闻讯，让熊佛西与吕君樵及时通知他进行防范。1949年5月27日上海解放，28日他就到广播电台广播，表达了他对上海解放的喜悦心情。6月4日，他出席了上海市长陈毅举行的文化界座谈会。7月2到19日，周信芳与梅兰芳、吕君樵、袁雪芬等作为南方代表到北京出席第一届全国文学艺术工作者代表大会。会上，周信芳当选为中华全国文学艺术界联合会全国委员会委员、中华全国戏剧工作者协会常务委员、中华全国戏曲改进会筹备委员会常务委员。8月间，周信芳又与梅兰芳一起出席上海市人民代表大会。9月间，周信芳又与梅兰芳、程砚秋、袁雪芬一起到北京出席第一届中国人民政治协商会议，会上周信芳当选为政协委员。10月1日，他参加了建国大典，登上了天安门城楼。
1950年初，成立上海市戏曲改进协会京剧分会，周信芳任主任委员。紧接着，又成立上海市人民政府文化局，周信芳任戏曲改进处处长。7月，中央文化部成立戏曲改进委员会，周信芳任委员。8月，上海市文化局戏曲改进处举办了上海市第二届戏曲研究班，周信芳任班主任。同年11月，中央文化部在北京召开全国戏曲工作会议，周信芳代表华东地区出席会议，担任大会主席团成员，并在大会上谈了自己对戏曲改革的看法。
1951年2月4日，上海市文化局举行了庆祝周信芳演剧五十周年暨戏曲界敬老大会，有19个剧种的老艺人205人参加。他在会上激动地说："五十多年来，我第一次以最大的兴奋和骄傲，做一个解放了的中国人民，做一个为人民服务的艺术工作者。"
周信芳在担任了全国政协委员，全国人民代表大会代表，中国文联全国委员会委员，中国戏剧家协会常务理事、副主席，上海市文联副主席，中国戏曲研究院副院长，华东戏曲研究院院长兼华东戏曲实验学校校长等众多职务的同时，还坚持演出，并且不断地排新戏，有《秦香莲》、《信陵君》、《闯王进京》等。
1951年4月首演《信陵君》，周信芳在剧中扮演信陵君，当时全国正掀起抗美援朝、保家卫国的高潮。这出戏叙述了暴秦侵略邻国，魏公子信陵君窃符救赵的历史故事，阐明了唇亡齿寒的道理，有强烈的现实意义。其后，他又代表上海京剧界表示要义演捐献一架"京剧号"飞机，他带头参加义演，率领华东戏曲研究院演了三天《四进士》，他与梅兰芳、盖叫天演了《龙凤呈祥》，与盖叫天合演了《莲花湖》，与杨宝森合演了《搜孤救孤》等剧目。1953年7月，周信芳参加中国人民第二届赴朝慰问团，担任副总团长，随团长贺龙入朝鲜，同行的有梅兰芳、程砚秋、马连良等。他们跋山涉水，顶风冒雨，在阵地上、坑道里、山洞里，到处演出，不畏辛苦，慰问演出达3月之久。
1952年10月6日，中央文化部举办的第一届全国戏曲观摩演出大会在北京开幕。周信芳在开幕式上讲话，并演出了《徐策跑城》。文化部为了表彰他多年来对京剧事业的杰出贡献，授予他荣誉奖（同时获奖者有梅兰芳、程砚秋、袁雪芬、常香玉、王瑶卿、盖叫天）。这次会演中有23个剧种的近百个剧目演出，周信芳观后认为很多地方剧种表现生活更生动、更自由，细腻逼真、感情充沛，认为这是程式化比较严重的京剧艺术应该努力学习的。在这之后，周把自己经常演出的传统老戏和自己的独家剧目进行反复加工、修改。比如在他多年演出的《琵琶记·描容上路》剧中，他不仅充分发挥了他擅长饰演各种老汉的本领，并参考了地方戏的演出，重新塑造了助人为乐的老人张广才，"让这位父执辈的叮咛嘱咐倾吐出了千千万万观众的心声".又如《乌龙院》"杀惜"原是以情杀为主要矛盾，解放后，周信芳感到有问题，便停演了几年，但他一直在考虑如何修改，1953年对剧本进行了几次大修改。修改后的剧本突出了宋江被逼上梁山的情节，特别是改写了"刘唐下书"一节，点明他与梁山好汉的关系，并以这封信为导火索，将"杀惜"的矛盾集中在因这封信引出政治上的是非上来。这是改得比较成功的一个范例。在同一时间，由华东戏曲研究院的吕仲、陈西汀、严朴、何慢等人协助，整理了《四进士》、《清风亭》、《鸿门宴》、《打严嵩》、《追韩信》、《徐策跑城》、《赵五娘》、《凤凰山、独木关》、《投军别窑》及《文天祥》等剧本，编成了《周信芳演出剧本集》。随后又将《打渔杀家》、《审头刺汤》、《金殿求计、单刀赴会》、《义责王魁》四个剧本编成《周信芳演出剧本新编》。并将其中《四进士》、《清风亭》、《乌龙院》、《追韩信》、《徐策跑城》、《打渔杀家》、《义责王魁》各剧的剧本及其演出时的唱念、表演、服装、道具等加以研究和总结，由卫明、吕仲记录整理，编成《周信芳舞台艺术》。其后又把这本书的内容与周信芳解放前后所写文章共约五十篇编成了《周信芳文集》。这几本书，从剧本到表演，较全面地反映了"麒派"艺术的特点。
"麒派"艺术被许多评论家认为具有朴实明快，健康生动，苍劲壮美，气象浑雄，富有生活气息，充满进步的、革命的激情，从生活出发，从人物出发，谨慎的继承传统，又经过大胆的革新，反映了中华民族的生活理想、道德观念和美学思想的艺术特点，因而被人们称为是南派（"海派"）京剧的代表。
1955年3月，在他60岁那年，华东大行政区撤销，华东京剧团与上海京剧团合并成上海京剧院，周信芳任院长。4月，为了表彰周信芳与梅兰芳的艺术成就和他们对京剧事业的贡献，中央文化部、全国文联、中国剧协联合在北京举办"梅兰芳、周信芳舞台生活五十年纪念活动",会上中国剧协主席田汉以《战斗的表演艺术家——周信芳》为题发表了讲话。周信芳致了答词，题为《衷心感谢党和毛主席的培养与领导》。
1956年10月，周信芳率上海京剧院访苏演出团到苏联访问演出。京剧团在莫斯科、列宁格勒等9个城市演出了53场，历时64天，上演了26个剧目。
周信芳在学习和借鉴其他剧种剧目方面也有显著的成绩。《十五贯》是周信芳向浙江省昆剧团学习的新排剧目，是周恩来总理建议他们学演的。这出戏昆剧团演出时，因改编成功，受到群众欢迎，曾被誉为"一出戏救活一个剧种".周信芳演出时，更突出了为民请命的况钟，成功地塑造了京剧舞台上的一个新的清官形象。其后，他又排演了《义责王魁》。这是以评弹艺人刘天韵、蒋月泉说唱的《义责》移植编成的，故事是全本《焚香记》中的一段。改编时，先发动大家来讨论研究，执笔者吕仲又三易其稿，最后周信芳自己又加以删芟充实，自编唱词。这出戏写家人王中仗义面责其主人王魁贪图富贵，忘恩负义，中了状元便休弃原配妻子敫桂英的故事。这出戏由周信芳亲自导演，并饰剧中老仆王中。周信芳向来擅长演老生，在饰演王中时，特地采用了武生的表演来塑造这一人物的刚直、战斗的性格，使这一形象更为丰满。
1959至1961年，周信芳经历了两件大事。一是1959年5月，他加入中国共产党；另一件是1961年12月，文化部和中国戏剧家协会联合举办了周信芳演剧生活六十年纪念活动，田汉在纪念会上讲了《向周信芳同志的战斗精神学习》，介绍了他60年的活动历程。周信芳在答词中把自己从艺60年分成了5个12年，总结为探新、求新、创新、革新、更新五个时期。他在这次纪念活动中，演出了《打渔杀家》、《乌龙院》、《四进士》，还演了新戏《义责王魁》和《海瑞上疏》。这一出《海瑞上疏》是周信芳为庆祝国庆10周年而编排的，由许思言执笔写成初稿，周信芳自己参加修改，自己导演并自任主演。剧中塑造了一个为了国家兴盛、政治清明，不畏权贵，不顾个人生死，上疏谏诤的刚正不阿、敢于直言的清官海瑞的形象。
1961年，《周信芳的舞台艺术》影片（其中包括《徐策跑城》和《乌龙院》两剧）拍摄完成，这是继前几年拍摄的《宋士杰》之后的又一部麒派艺术影片。其后，年近70的周信芳又编演了新戏《澶渊之盟》。这出戏写的是宋辽间的一场战争，刻画了一个忠心为国、举足轻重的重臣寇准。剧本由陈西汀编写，周信芳仍是亲自修改，自任导演，并主演寇准。
1964年6月，全国京剧现代戏观摩演出大会在北京举行，周恩来总理决定请周信芳为顾问。他在会上提出京剧演现代剧要从生活出发，向传统借鉴。在闭幕式上，康生点了田汉、阳翰笙、孟超的名，说他们的作品是向党进攻。翌年，1965年10月，姚文元写的《评新编历史剧〈海瑞罢官〉》一文发表（《海瑞罢官》是吴晗编剧，马连良主演的），文中点到了《海瑞上疏》。紧接着张春桥到上海京剧院，当众指出周信芳搞的《海瑞上疏》是反党的大毒草。1966年2月，《解放日报》发表丁学雷的文章《〈海瑞上疏〉为谁效劳？》，说《海瑞上疏》同《海瑞罢官》"是一根藤上结的两个瓜".5月16日，"无产阶级文化大革命"开始了；10天之后，5月26日，《解放日报》又发表了方泽生的《〈海瑞上疏〉必须继续批判》，更进一步说："《海瑞上疏》是一棵不折不扣的反党反社会主义的大毒草。"在这篇文章中公开点了周信芳和支持这出戏的中央宣传部副部长周扬的名字。
紧接着，周信芳的家被抄，人被押上高架线路修理车在全市游街示众，批斗会更是一个接一个地开个不停。1968年11月，周信芳被捕入狱，到第二年才获释回家。1974年，"四人帮"控制的上海市革命委员会作出了将周信芳开除党籍、定为反革命分子的处理决定，因周信芳不予接受，后才将结论改为：敌我矛盾作人民内部矛盾处理。
1975年3月8日，周信芳被迫害致死。终年80岁。
粉碎"四人帮"后，1978年8月16日，上海市各界人士700余人在上海龙华革命公墓举行"周信芳同志平反昭雪大会",并举行骨灰安放仪式。
